Tratamento com metformina em células de câncer de mama e sua influência na produção de espécies reativas de oxigênio (EROS)

Resumo

O câncer é considerado o mal do século, segundo a OMS, sendo o de mama o
mais letal entre as mulheres. Diferenças metabólicas, em comparação com as células
saudáveis, favorecem o desenvolvimento e a sobrevivência das células cancerígenas.
Nesse sentido, as células neoplásicas apresentam níveis basais de espécies reativas de
oxigênio (EROs) elevados, porém desenvolvem mecanismos de defesa através da
produção de enzimas com ação antioxidante - catalase, superóxido dismutase, glutationa
peroxidase e glutationa - que evitam o estresse oxidativo e consequente morte celular.
Uma vez que a ativação da AMPK nas células cancerígenas tratadas com metformina
está associada à menor síntese de EROs, compreender melhor o comportamento desse
fenômeno em células cancerígenas sob tratamento com metformina pode representar
mais uma possibilidade no desenvolvimento de ferramentas que poderão ser utilizadas na
terapia de combate ao câncer. Para realização do projeto, foram cultivadas células da
linhagem MDA-MB-231 (adenocarcinoma mamário humano) em meio L-15 (Leibovitz
Medium). No teste de viabilidade foram semeadas cerca de 7x103 células, em triplicata,
para o tratamento de 4 concentrações com metformina. A citotoxidade da droga nessas
células foram determinadas pelo ensaio padrão por brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium (MTT). As placas foram lidas a 595 nm no
espectofotômetro Spectramax M5 (Molecular Devices USA), sendo a porcentagem de
inibição do crescimento celular determinada através da comparação da densidade celular
das células tratadas com as células controle. Para as análises da expressão gênica cerca
de 750x103 células foram plaqueadas e submetidas ao tratamento com metformina com
3 concentrações distintas determinadas pelo resultado obtido no teste de viabilidade
(1,25mM, 10mM e 20mM). Após o tempo de exposição de tratamento (24h), as células
foram submetidas a extração de RNA utilizando o kit Power SYBR® Green Cells-to-
CT™(Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, foram sintetizados cDNAs com utilização
do kit SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen®). Para análise dos
níveis de expressão gênica foram desenhados iniciadores para os genes que codificam as
enzimas Superóxido Dismutase, Catalase e Heme Oxigenase, bem como para o gene do
controle endógeno (GAPDH), para utilização na técnica de PCR em tempo real. O teste
de viabilidade para as 5 concentrações de metformina, indicou uma mortalidade de
aproximadamente 15,6% das células MDA-MB-231 tratadas com 1,25mM, 17,6% com
2,5mM, 33,8% com 5mM, 52,55% com 10mM e, por fim, 78% de mortalidade com a
utilização de 20mM, demonstrando uma mortalidade dose-dependente. A partir da análise
de variância com um fator (one-way ANOVA), constatou-se que há comparação
estatisticamente significativa entre o grupo controle e as concentrações 1,25mM, 10mM e
20mM, sendo essas concentrações utilizadas nos ensaios para análise da expressão de
enzimas antioxidantes. Os resultados da qPCR demonstraram que não houve alteração
significativa nos níveis de expressão gênica destas enzimas em relação ao controle, fato
que pode estar relacionado com a menor produção de EROs nas células devido à inibição
do complexo I da cadeia transportadora de elétrons. Ainda nesse sentido, os estudos que
investigam a relação entre a metformina e o estresse oxidativo em linhagens de células
carcinogênicas mamárias ainda são escassos, apontando a necessidade em ampliar o
desenvolvimento de pesquisas que investigam essa relação